Feline leukemia virus (FeLV) causes a range of neoplasticand degenerative diseases in cats. To obtain a more sensitiveand convenient diagnosis of the disease, we preparedmonoclonal antibodies specific for the FeLV p27 to develop arapid diagnostic test with enhanced sensitivity andspecificity. Among these antibodies, we identified two clones(hybridomas 8F8B5 and 8G7D1) that specifically bound toFeLV and were very suitable for a diagnostic kit. The affinityconstants for 8F8B5 and 8G7D1 were 0.35 × 109 and 0.86 ×109, respectively. To investigate the diagnostic abilities of therapid kit using these antibodies, we performed severalclinical studies. Assessment of analytical sensitivity revealedthat the detection threshold of the rapid diagnostic test was 2ng/mL for recombinant p27 and 12.5 × 104 IU/mL for FeLV.When evaluating 252 cat sera samples, the kit was found tohave a kappa value of 0.88 compared to polymerase chainreaction (PCR), indicating a significant correlation betweendata from the rapid diagnostic test and PCR. Sensitivity andspecificity of the kit were 95.2% (20/21) and 98.5% (257/261),respectively. Our results demonstrated that the rapiddiagnostic test would be a suitable diagnostic tool for therapid detection of FeLV infection in cats.