Isolating dissolved organic matter (DOM) is a preliminary step that improves the accuracy of its characterization.In this study, DOM in brackish water was clearly separated and evaluated by multiplecharacterization analyses. The sample was divided into three fractions by preparative high-performanceliquid chromatography (preparative HPLC) according to molecular size. The homogeneity of each fractionwas estimated by analytical size exclusion chromatography (SEC) and fluorescence excitation-emissionmatrix (FEEM). Pyrolysis gas chromatography-mass spectrometry (Py-GC/MS) and liquidchromatography-organic carbon detection (LC-OCD) were used to characterize the physicochemicalproperties of each fraction. Py-GC/MS revealed that Fraction 1 consisted of evenly distributed organicmatter in order polysaccharides, proteins, polyhydroxy aromatics, lignins, and lipids. However, Fraction 2was primarily composed of dominant lipids and low portion of proteins, and Fraction 3 was composedpredominantly of lignins and lipids. The LC-OCD results showed that Fractions 1 and 2 had similarorganic carbon (OC) compositions: a humic substance (ca. 37%), building blocks (ca. 10%), and neutrals(ca. 37%), whereas Fraction 3 contained a high proportion of neutrals (62%). In the fouling experiments,the distinct DOM characteristics in each fraction resulted in different declining flux behaviors, ranked as:Fraction 2 > Fraction 1 > Fraction 3.